氯霉素檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)水產(chǎn)組織、畜禽組織、肝臟、蛋類、蜂蜜、牛奶及飼料等樣本中的氯霉素藥物（Chloramphenicol，CAP），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的氯霉素藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗氯霉素藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氯霉素藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

組織、肝臟、蜂蜜、牛奶……………0.025ppb

蛋類……………………………………0.1ppb

尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉……0.05ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

氯霉素 …………………………………100%

甲砜霉素、氟甲砜霉素………………＜0.1%

 2.5 樣本回收率：

組織、肝臟……………………………85%±20%

蜂蜜、腸衣……………………………85%±25%

牛奶、飼料……………………………75%±25%

尿液、血清……………………………70%±20%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說(shuō)明書(shū)………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、醋酸鈉、醋酸

、亞硝基鐵氰hua鉀（K₂Fe(CN)₅(NO)_?2H₂O）、葡萄糖苷酸酶、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵氰hua鉀溶液（牛奶、奶粉樣本）

11.9g亞硝基鐵氰hua鉀加去離子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。

配液3：0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液（尿液樣本）

    2.4g醋酸鈉加去離子水500ml溶解，加1.2ml醋酸混勻。

配液4：乙腈-水溶液

    V乙腈:V水=84:16

配液5：復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織、魚(yú)、蝦、肝臟樣本處理方法 

1）稱取均質(zhì)后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，先加入3ml去離子水振蕩混勻，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?.5ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測(cè)下限：0.025ppb

5.3.2 血清、血漿樣本處理方法

1）取1ml血清或血漿至離心管中，加入2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，或靜置使水相與有機(jī)相分離；

2）取全部上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

5.3.3 尿液樣本處理方法

1）取2ml尿液至離心管中，加入0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶，混勻，37℃水解2小時(shí)以上（或過(guò)夜）；

2）將上述溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取4ml上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用1ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?/span>

4）取50μl進(jìn)行分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

5.3.4 蜂蜜樣本處理方法

1）取2±0.05g蜂蜜于離心管中，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?/span>

4）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測(cè)下限：0.025ppb

（檢測(cè)下限0.025ppb，定量下限0.1ppb，因某些樣本有干擾建議以0.1ppb作為陽(yáng)性判定值）

5.3.5 腸衣樣本處理方法

1）腸衣經(jīng)清洗后均質(zhì)，稱取均質(zhì)后的樣本1±0.05g于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體5ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?.5ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

5.3.6 牛奶樣本處理方法

1）將牛奶樣本15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上層脂肪，取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中，加250ul 亞硝基鐵氰hua鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體2.2ml（相當(dāng)于2ml鮮奶）于另一離心管中，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

3）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

4）用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?/span>

5）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測(cè)下限：0.025ppb

（檢測(cè)下限0.025ppb，定量下限0.05ppb，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽(yáng)性判定值）

5.3.7 奶粉樣本處理方法

1）取2±0.05g奶粉于50ml離心管中，用10ml去離子水溶解，加入1ml 亞硝基鐵氰hua鉀溶液（配液1）和1ml 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體3.6ml（相當(dāng)于0.6g奶粉）于另一離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

3）取上層液體4ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

4）用0.4ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?/span>

5）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

（檢測(cè)下限0.05ppb，定量下限0.15ppb，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽(yáng)性判定值）

 5.3.8 蛋類樣本處理方法

1）取3±0.05g均質(zhì)的蛋類樣本于50ml離心管中，加9ml乙腈-水溶液振蕩混合2分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體3ml于另一離心管中，加入3ml去離子水，再加4.5ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

3）取全部上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

4）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測(cè)下限：0.1ppb

（檢測(cè)下限0.1ppb，定量下限0.3ppb）

5.3.9 飼料樣本處理方法

1）取2±0.05g均質(zhì)的飼料于50ml離心管中，用2ml去離子水溶解，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上層液體3ml載50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.05ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。